RESUMEN

Background: Since the first success in sheep, the production of viable cloned offspring by somatic cell nuclear transfer (SCNT) in various mammals has increased significantly. The incidence of pregnancy failure and fetal death, however, is still very high, whatever the species, and impairs the commercial development of this technology, even in the bovine species where the success rates are highest compared to other species. Review: In cattle, most gestation losses are initially due to abnormal implantation and poor placental development leading to fetal demise during the early post-implantation period (30 to 70 days of pregnancy). Thereafter, in continuing pregnancies, losses usually occur in the last third of gestation and affect about 25% of the on-going pregnancies, with very large differences according to phenotype. These are currently referred to as the Large Offspring Syndrome (LOS), Large Placenta Syndrome or Abnormal Offspring Syndrome. In all cases, the placenta appears to be central to the onset of the pathology, with placentomegaly and hydrallantois being the most common features. Clinically, transabdominal ultrasound monitoring of fetal and placental development as well as the measurement of maternal plasma concentrations of pregnancy associated glycoproteins (PAG) are recommended in order to monitor the pregnancies. Humane termination of the pregnancies by Caesarian section or slaughtering of the affected animals is recommended when the pathology onset is diagnosed more than 2 weeks prior to term. Underlying mechanisms include abnormal placental vascularization, which is present early in SCNT placental development. Enzymatic response to oxidative stress is also modified. In the first trimester, several genes expressed in the trophoblast have been found to be differentially expressed between SCNT and control conceptuses, including placental lactogen (PL), the PAG, prolactin related protein-1 (PRP-1) and Dickkopf-1(DKK-1), to name a few. All these proteins are expressed in the Binucleate cells (BNC) of the trophoblast and thus, indicate that BNC function may be affected in SCNT from very early in gestation, thereby compromising placental development. Later in pregnancy, it has been shown that transplacental exchanges are disturbed, in particular those related to glucose metabolism. Moreover, endocrine function is altered compared to controls, with decreased estrogen secretion and modifications in PAG secretion, resulting in largely elevated maternal plasma concentrations. Gene expression patterns are affected, with most prominent functional effects involving cell cycle, cell signaling pathways, molecular transport, DNA replication, recombination and repair. Most of the affected genes are downregulated. Finally, many of the pathologies reported with SCNT pregnancies resemble abnormalities reported with either mutations or deletions of imprinted genes or dysregulation of imprinted gene expression, and the expression of several imprinted genes have been shown to be abnormal in SCNT placenta. Conclusions: In conclusion, pregnancy failure after SCNT is due to multiple factors affecting, implantation, placental development, morphology, vascularization, responses to oxidative stress and the epigenetic control of gene expression. If abnormal nuclear reprogramming may induce long term effects in bovine SCNT, these effects may also be due to fetal programming due to abnormal placental function and perturbed fetal development.

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RESUMEN: Los objetivos de este trabajo fueron los de producir embriones de pudú, obtenidos por la transferencia de núcleos de fibroblastos de la oreja de pudú en ovocitos de un rumiante domésticos que es el bovino. Para posteriormente en un trabajo futuro proceder a la transferencia de embriones de pudú, al útero de hembras receptoras sincronizadas de otra especie. Se obtuvieron biopsias de 1 mm aproximadamente del borde externo de la orejas de dos ciervos pudu machos del jardín zoológico Buin-Zoo, Santiago de Chile. Las líneas celulares han sido establecidas y conservadas según los protocolos utilizados para las bovinos. Los ovocitos son obtenidos por punción del complejo cúmulos-ovocito (COC).desde ovarios de vacas recuperados del matadero. Cada ovocito es enucleado y fusionado con un fibroblasto aislado insertado bajo la zona pelúcida. La fusión de membranas celulares es obtenida por choques eléctricos. En cuanto a la cronología, observamos que al segundo día se forma una etapa de dos blastómeras, al tercer día mórulas de 8 a 16 células, y desde el cuarto día se ha diferenciado como blastocisto, el cuál al séptimo día termina por eclosionar de la zona pelúcida.La obtención de blastocistos embrionarios indica que es posible obtener embriones de pudú mediante clonaje heteroespecífico, aunque, el porcentaje de éxito obtenido es relativamente bajo. Queda aun por verificar la viabilidad de los embriones así obtenidos después de la transferencia in útero.

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The somatic cloning by transfer of the nuclei of differentiated adult cells to previously enucleated oocytes is a promising technique for the production of embryos of high genetic value. The better mastering of somatic cloning gives us the possibility to produce embryos from endangered species. The huemul is an Andean native deer, that has been declared an endangered species, it holds a great patrimonial value and it is a Chilean national emblem. In Chile the huemul has the status of protected animal on thirteen Parks and National Reserves managed by Corporacion Nacional Forestal (CONAF). This protection, however, is considered insufficient due to the few geographical connections between the different protected areas. Furthermore, a great proportion of these areas are not subjected to use or they do not constitute adequate habitats. Many authors have proposed that the use of biotechnological methods in reproduction and assisted procreation may help conservational programs orientated to the protection of deer species threatened by extinction. All the anterior prompted us to initiate this study concerning the production of cloned huemul embryos.

El clonaje somático por transferencia del núcleo de células diferenciadas adultas a un ovocito, al que se le ha extraído el núcleo (enucleado), es una técnica prometedora para la producción de embriones de alto valor genético. El mejor dominio del clonaje somático da la posibilidad de producir embriones de especies amenazadas de extinción. El huemul es un ciervo andino autóctono, declarado como especie en peligro de extinción. tiene un gran valor patrimonial, y es emblema de la nación chilena. En este país, el huemul se encuentra protegido en trece Parques y Reservas Nacionales, manejadas por la Corporación Nacional Forestal (CONAF). Sin embargo, su protección se considera insuficiente debido a la baja conectividad entre las áreas protegidas y además, una gran proporción de estas áreas no son utilizadas o no constituyen un hábitat adecuado. Para las especies de cérvidos en vías de extinción el uso de biotecnología reproductiva y métodos de procreación asistida, según varios autores, pueden ayudar a los programas de conservación. Las técnicas clásicas de producción de embriones basados en superovulación, inseminación artificial y transferencia embrionaria,en los cérvidos, han resultado muy dificultosa. Esto, sumado a las características del huemul, que no permite su estabulación en cautiverio, nos ha movido a iniciar un estudio tendiente a la producción de embriones clonados de esta especie.

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La Biología del Desarrollo y la Biotecnología han avanzado enormemente en los últimos años. Los estudios que se están realizando actualmente con nuevas técnicas moleculares, nos conducen a una nueva era en el diagnóstico y en el tratamiento de muchas enfermedades congénitas. Actualmente, se ha logrado aplicar los conocimientos derivados de ella, con incipiente éxito, en los aspectos productivos y también en la terapia de distintas enfermedades del Hombre y de otros animales y, por último, existen importantes perspectivas en la protección de especies amenazadas. En este Review, se analizan algunos de los aspectos técnicos más interesantes de la clonación, producción de quimeras y obtención de células pluripotenciales, como también los objetivos y proyecciones en el campo veterinario y de la salud animal y humana.

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