RESUMEN

The yellow fever (YF) 17D vaccine is one of the most effective human vaccines ever created. The YF vaccine has been produced since 1937 in embryonated chicken eggs inoculated with the YF 17D virus. Yet, little information is available about the infection mechanism of YF 17DD virus in this biological model. To better understand this mechanism, we infected embryos of Gallus gallus domesticus and analyzed their histopathology after 72 hours of YF infection. Some embryos showed few apoptotic bodies in infected tissues, suggesting mild focal infection processes. Confocal and super-resolution microscopic analysis allowed us to identify as targets of viral infection: skeletal muscle cells, cardiomyocytes, nervous system cells, renal tubular epithelium, lung parenchyma, and fibroblasts associated with connective tissue in the perichondrium and dermis. The virus replication was heaviest in muscle tissues. In all of these specimens, RT-PCR methods confirmed the presence of replicative intermediate and genomic YF RNA. This clearer characterization of cell targets in chicken embryos paves the way for future development of a new YF vaccine based on a new cell culture system.

Asunto(s)

RESUMEN

The use of avian animal models has contributed to the understanding of many aspects of the ontogeny of the hematopoietic system in vertebrates. However, specific events that occur in the model itself are still unclear. There is a lack of consensus, among previous studies, about which is the intermediate site responsible for expansion and differentiation of hematopoietic cells, and the liver's contribution to the development of this system. Here we aimed to evaluate the presence of hematopoiesis in the yolk sac and liver in chickens, from the stages of intra-aortic clusters in the aorta-genital ridges-mesonephros (AGM) region until hatching, and how it relates to the establishment of the bone marrow. Gallus gallus domesticus L. embryos and their respective yolk sacs at embryonic day 3 (E3) and up to E21 were collected and processed according to standard histological techniques for paraffin embedding. The slides were stained with hematoxylin-eosin, Lennert's Giemsa, and Sirius Red at pH 10.2, and investigated by light microscopy. This study demonstrated that the yolk sac was a unique hematopoietic site between E4 and E12. Hematopoiesis occurred in the yolk sac and bone marrow between E13 and E20. The liver showed granulocytic differentiation in the connective tissue of portal spaces at E15 and onwards. The yolk sac showed expansion of erythrocytic and granulocytic lineages from E6 to E19, and E7 to E20, respectively. The results suggest that the yolk sac is the major intermediate erythropoietic and granulopoietic site where expansion and differentiation occur during chicken development. The hepatic hematopoiesis is restricted to the portal spaces and represented by the granulocytic lineage.

Asunto(s)

RESUMEN

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (barbatimão) is a tree belonging to the Fabaceae family, and it is commonly found in the southeastern Brazilian cerrado. The stem bark of this tree is traditionally used as an anti-inflammatory and antiseptic agent to treat leucorrhea and diarrhea, as well as to promote wound healing (owing to the presence of proanthocyanidins). Proanthocyanidins were obtained from the ethanolic extract of S. adstringens stem bark and assessed by reversed phase-high performance liquid chromatography with an ultraviolet/diode array detector. The identified compounds included gallic acid, catechin, gallocatechin (GC), epigallocatechin, and epigallocatechin gallate (EGCG). The selected markers, GC and EGCG, were simultaneously used for chromatographic validation (linearity range: 30-330 ng, equivalent to 3-33 µg/mL; r>0.998). The method showed precision (intra-day relative standard deviation [RSD]: 1.72% for GC; 1.16% for EGCG; inter-day RSD: 1.74%-2.60% for both markers), accuracy, robustness, and selectivity. The limits of detection and quantitation were 0.29 µg/ml and 0.89 µg/ml for GC, and 0.88 µg/mL and 2.67 µg/mL for EGCG, respectively. In addition, S. obovatum was evaluated and showed an average of 12.2 µg/mL for GC (equivalent to 1.22% w/w) and 14.2 µg/mL for EGCG (equivalent to 1.42% w/w) in the ethanolic extract. The quantitative results were compared to those obtained for S. adstringens, which showed that the markers are present in both species.

Stryphnodendron adstringens (Mart.) Coville (barbatimão) é uma árvore da família Fabaceae encontrada no cerrado do sudeste do Brasil. As cascas do caule das espécies são tradicionalmente utilizadas como agente antiinflamatório e antisséptico para o tratamento de diarreia e leucorreia, bem como para promover a cicatrização de feridas, devido à presença de proantocianidinas. Estas substâncias obtidas a partir do extracto etanólico (EE) de cascas do caule de S. adstringens foram avaliadas por cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa. As substâncias identificadas foram ácido gálico, catequina, galocatequina (GC), epigalocatequina e galato de epigalocatequina (EGCG). Os marcadores selecionados, GC e EGCG, foram utilizados simultaneamente para validação cromatográfica (intervalo de linearidade 30-330 ng, equivalente a 3-33 µg/mL, r>0,998). O método mostrou precisão (intra-dia DPR 1,72% para GC; 1,16% para EGCG; inter-dia DPR 1,74%-2,60% para ambos os marcadores), exatidão, robustez e seletividade. Os limites de detecção e de quantificação de 0,29 µg/mL e 0,89 µg/mL para a GC, e 0,88 ng/mL e 2,67 µg/mL para EGCG, respectivamente. Outra espécie (S. obovatum) avaliada, mostrou valores médios 12,2 µg/mL de GC (equivalente a 1,22% p/p) e 14,2 µg/mL de EGCG (equivalente a 1,42% p/p) encontrados no EE. Os resultados quantitativos comparam-se aos de S. adstringens e mostram que tais marcadores estão presentes em ambas as espécies.

Asunto(s)

RESUMEN

O presente trabalho objetivou estudar aspectos morfológicos e funcionais do sistema hematopoético em diferentes fases do desenvolvimento embrionário de Gallus gallus domesticus L. Ovos embrionados foram incubados entre 26 horas a 21 dias de desenvolvimento (dd). Embriões e seus anexos foram coletados diariamente e blocos histológicos foram produzidos. Seções de cada bloco foram coradas pelas técnicas HE, Giemsa de Lennert, Sirius Red pH 10,2 e PAS, analisando-se o saco vitelínico, fígado e medula óssea. O saco vitelínico foi o único sítio hematopoético dentre 13 e 14dd. Dos 14 aos 20dd, a hematopoese ocorreu no saco vitelínico e na medula óssea. O fígado mostrou diferenciação granulocítica no conjuntivo dos espaços portais a partir dos 15dd. As linhagens eritrocítica e granulocítica se expandiram no saco vitelínico, respectivamente de 6 a 19dd e de 7 a 20dd. Na medula óssea, os granulócitos foram observados aos 10dd, seguindo o estabelecimento da granulopoese no estroma aos 14dd e da eritropoese nos sinusóides aos 15dd. Aspectos topográficos e morfológicos de sacos vitelínicos foram detalhados, associando macroscopia à microscopia. Membranas vitelínicas de 12 e 14dd foram analisadas macroscopicamente, regionalizadas em áreas, observadas ao microscópico estereoscópico e processadas. Os cortes foram corados em HE e escaneados em digitalizador de lâminas. Macroscopicamente, as membranas vitelínicas possuem três áreas concêntricas. A microscopia estereoscópica demonstrou uma cobertura translúcida nas veias vitelínicas e que varia de translúcida a opaca nas artérias. Em ambos os vasos, essa cobertura é o endoderma. Eritropoese e granulopoese ocorreram nas adjacências das artérias e nas três regiões. Em membranas vitelínicas de diferentes estádios, as colorações PAS, PAS-AB (pH 2,5 e 1,0), picrosirius, resorcina fucsina de Weigert e reticulina de Gomori foram realizadas, além de imunohistologia para diferentes anticorpos. Observou-se positividade para alfa-actina de músculo liso na vasculatura vitelínica e expressão para a fibronectina no entorno dos vasos e na matriz extracelular durante o desenvolvimento. Análises tomográficas à microscópia confocal de membranas vitelínicas coradas com berberina e laranja de acridina demonstraram a presença de ramos arteriais. Focos de granulopoese se dispuseram numa matriz constituída por glicoproteínas, glicosaminoglicanos, fibras reticulares e fibronectina. A eritropoese ocorre nos ramos arteriais, delimitados pelas moléculas supracitadas, fibras colágenas e elásticas. A concentração e localização das fibras reticulares variaram de acordo com o desenvolvimento, sendo presentes entre artérias, seus ramos e endoderma; entre endoderma e veias. Células endodérmicas, eritroblastos e granulócítos em diferenciação expressaram VEGF. Eritroblastos foram VEGF-C positivos e a expressão de VEGFR-3 mostrou-se presente em vasos de pequeno calibre. Em conclusão, o presente estudo sugere que: 1- o saco vitelínico é o principal sítio de expansão no Gallus gallus sp.; 2- a hematopoese hepática é restrita à granulopoese, aos espaços porta e quando a medula óssea é funcional; 3- a eritropoese no saco vitelínico e medula óssea do Gallus gallus sp. está associada ao endotélio e à granulopoese, ao estroma; 4- as fibras reticulares no saco vitelínico desempenham funções de sustentação, na granulopoese e participam da morfogênese deste anexo; 5- células endodérmicas e hematopoéticas modulam a angiogênese no saco vitelínico.

Asunto(s)