RESUMEN
INTRODUCTION: Toxocara canis is a pathogenic nematode of canines which can be accidentally transmitted to humans. Although serology is the most important diagnostic tool for this zoonosis, diagnostic kits use crude excretion/secretion antigens, most of them being glycoproteins which are not species-specific and may cross-react with antibodies generated against other parasites. OBJECTIVES: To produce the rTES-30 recombinant antigen of Toxocara canis and evaluate it in the immunodiagnosis of toxocariasis. MATERIALS AND METHODS: The gene that codes for TES-30 was cloned in the expression vector pET28a (+) using single-stranded oligonucleotides united by PCR. The protein rTES-30 was purified by Ni2+ affinity chromotography. Seroreactivity of rTES-30 was evaluated by immunoblot. Given that there is no gold standard test, the behaviour of the antigen was compared with the method that is routinely used to immunodiagnose toxocariasis, i.e., the conventional ELISA technique using excretion/secretion antigens. RESULTS: The rTES-30 was produced from an Escherichia coli LB culture which yielded 2.25 mg/L of the antigen with a purity of 95%. The results obtained showed 73% (46/63) concordance of reactivity between the rTES-30 immunoblot and the conventional ELISA, and 100% concordance with the nonreactive sera (21). Nineteen of the 21 sera positive for other parasitoses reacted with ELISA, while only seven of these were positive with the rTES-30 immunoblot. Concordance between the ELISA and the immunoblot was moderate (kappa coefficient: 0.575; 95% CI: 0.41- 0.74). CONCLUSIONS: The data presented show the potential of the rTES-30 inmunoblot for confirmation of possible ELISA positives, not only in epidemiological studies, but also as a candidate for the development of diagnostic tests for ocular toxocariasis in Colombia.
Asunto(s)
Antígenos Helmínticos/sangre , Immunoblotting , Toxocara canis/inmunología , Toxocariasis/diagnóstico , Animales , Antígenos Helmínticos/genética , Antígenos Helmínticos/aislamiento & purificación , Secuencia de Bases , Cromatografía de Afinidad , Ensayo de Inmunoadsorción Enzimática , Escherichia coli , Infecciones Parasitarias del Ojo/diagnóstico , Genes Sintéticos , Humanos , Fragmentos de Péptidos/análisis , Fragmentos de Péptidos/genética , Fragmentos de Péptidos/inmunología , Fragmentos de Péptidos/aislamiento & purificación , Proteínas Recombinantes de Fusión/análisis , Proteínas Recombinantes de Fusión/aislamiento & purificación , Solubilidad , Toxocariasis/sangreRESUMEN
Introducción. Toxocara canis es un nematodo patógeno de cánidos que accidentalmente puede ser transmitido a los humanos. A pesar de la importancia de la serología para el diagnóstico de esta zoonosis, los kits diagnósticos usan antígenos crudos de excreción-secreción, en su mayoría glucoproteínas que no son específicas de especie, por lo cual pueden presentarse reacciones cruzadas con anticuerpos generados contra otros parásitos. Objetivos. Producir el antígeno recombinante TES-30 de T. canis y evaluarlo para el inmunodiagnóstico de la toxocariasis. Materiales y métodos. Se clonó el gen que codifica TES-30 en el vector de expresión pET28a (+), usando oligonucleótidos de cadena sencilla unidos mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR). La proteína rTES-30 se purificó por cromotografia de afinidad (Ni 2+ ). La reacción serológica de rTES-30 se evaluó mediante immunoblot . Teniendo en cuenta que no existe una prueba de referencia , se observó el comportamiento del antigeno en comparación con la prueba de rutina para el inmunodiagnóstico de la toxocariasis, es decir, la técnica ELISA convencional con antígenos de excreción-secreción. Resultados. El rTES-30 se produjo a partir de un cultivo de Escherichia coli LB, con un rendimiento de 2,25 mg/l y 95 % de pureza. La concordancia de la reacción entre el immunoblot rTES-30 y la ELISA convencional, fue de 73 % (46/63) y de 100 % con los 21 sueros no reactivos. De los 21 sueros con diagnóstico de otras parasitosis, 19 fueron reactivos con ELISA, mientras que tan solo siete fueron positivos con el immunoblot rTES-30. La concordancia entre la ELISA y el immunoblot fue moderada (índice kappa de 0,575; IC 95% 0,41-0,74). Conclusiones. Los datos presentados respaldan la utilidad del immunoblot r TES-3 0 para la confirmación de los posibles positivos por ELISA, no solo en los estudios epidemiológicos, sino también, como candidato para el desarrollo de pruebas diagnósticas de la toxocariasis ocular en Colombia.
Introduction: Toxocara canis is a pathogenic nematode of canines which can be accidentally transmitted to humans. Although serology is the most important diagnostic tool for this zoonosis, diagnostic kits use crude excretion/secretion antigens, most of them being glycoproteins which are not species-specific and may cross-react with antibodies generated against other parasites. Objectives: To produce the rTES-30 recombinant antigen of Toxocara canis and evaluate it in the immunodiagnosis of toxocariasis. Materials and methods: The gene that codes for TES-30 was cloned in the expression vector pET28a (+) using single-stranded oligonucleotides united by PCR. The protein rTES-30 was purified by Ni 2+ affinity chromotography. Seroreactivity of rTES-30 was evaluated by immunoblot. Given that there is no gold standard test, the behaviour of the antigen was compared with the method that is routinely used to immunodiagnose toxocariasis, i.e., the conventional ELISA technique using excretion/secretion antigens. Results: The rTES-30 was produced from an Escherichia coli LB culture which yielded 2.25 mg/L of the antigen with a purity of 95%. The results obtained showed 73% (46/63) concordance of reactivity between the rTES-30 immunoblot and the conventional ELISA, and 100% concordance with the non-reactive sera (21). Nineteen of the 21 sera positive for other parasitoses reacted with ELISA, while only seven of these were positive with the rTES-30 immunoblot. Concordance between the ELISA and the immunoblot was moderate (kappa coefficient: 0.575; 95% CI: 0.41- 0.74). Conclusions: The data presented show the potential of the rTES-30 inmunoblot for confirmation of possible ELISA positives, not only in epidemiological studies, but also as a candidate for the development of diagnostic tests for ocular toxocariasis in Colombia.