RESUMEN
BACKGROUND: Inorganic PPases are essential metal-dependent enzymes that convert pyrophosphate into orthophosphate. This reaction is quite exergonic and provides a thermodynamic advantage for many ATP-driven biosynthetic reactions. We have previously demonstrated that cytosolic PPase from R. microplus embryos is an atypical Family I PPase. Here, we explored the functional role of the cysteine residues located at the homodimer interface, its redox sensitivity, as well as structural and kinetic parameters related to thiol redox status. METHODS: In this work, we used prokaryotic expression system for recombinant protein overexpression, biochemical approaches to assess kinetic parameters, ticks embryos and computational approaches to analyze and predict critical amino acids as well as physicochemical properties at the homodimer interface. RESULTS: Cysteine 339, located at the homodimer interface, was found to play an important role in stabilizing a functional cooperativity between the two catalytic sites, as indicated by kinetics and Hill coefficient analyses of the WT-rBmPPase. WT-rBmPPase activity was up-regulated by physiological antioxidant molecules such as reduced glutathione and ascorbic acid. On the other hand, hydrogen peroxide at physiological concentrations decreased the affinity of WT-rBmPPase for its substrate (PPi), probably by inducing disulfide bridge formation. CONCLUSIONS: Our results provide a new angle in understanding redox control by disulfide bonds formation in enzymes from hematophagous arthropods. The reversibility of the down-regulation is dependent on hydrophobic interactions at the dimer interface. GENERAL SIGNIFICANCE: This study is the first report on a soluble PPase where dimeric cooperativity is regulated by a redox mechanism, according to cysteine redox status.
Asunto(s)
Pirofosfatasa Inorgánica/metabolismo , Multimerización de Proteína , Compuestos de Sulfhidrilo/metabolismo , Garrapatas/enzimología , Aminoácidos/metabolismo , Animales , Calcio/farmacología , Disulfuros/metabolismo , Electroforesis en Gel de Poliacrilamida , Fluoruros/farmacología , Disulfuro de Glutatión/metabolismo , Interacciones Hidrofóbicas e Hidrofílicas , Cinética , Modelos Moleculares , Mutagénesis Sitio-Dirigida , Proteínas Mutantes/metabolismo , Oxidantes/farmacología , Oxidación-Reducción , Multimerización de Proteína/efectos de los fármacos , Proteínas Recombinantes/metabolismo , Sustancias Reductoras/farmacologíaRESUMEN
Fundamentos - O processo de envelhecimento tecidual é evidente nas modificações visíveis na pele, resultando em importantes implicações psicológicas para o indivíduo e crescente interesse científico.Objetivos - O presente trabalho objetivou analisar as alterações da pele normal com o envelhecimento mediante estratégias de histomorfometria e autofluorescência. Métodos - Foram coletadas amostras de pele do abdômen de 18 cadáveres, incluindo cinco indivíduos jovens (menos de 20 anos), sete indivíduos com idade intermediária (20-60 anos) e seis indivíduos idosos (mais de 60 anos). Foram feitos cortes histológicos em parafina seguidos de coloração pela Hematoxilina-Eosina (H&E) e pelo tricrômio de Van Gieson-elastina. Avaliaram-se a espessura da epiderme e derme, e a superfície de contato epidermo-dérmica. Investigaram-se ainda as modificações qualitativas do aparelho colágeno-elástico, considerando sua disposição espacial na derme. Espécimes corados em H&E também foram utilizados para autofluorescência. Resultados - A espessura da epiderme e derme do grupo idoso foi significativamente diminuída (p<0,05) em relação aos demais grupos. Os grupos idoso e intermediário exibiram acentuada redução na superfície de contato epiderme-derme (p<0,05). Detectaram-se a perda da distribuição em rede das fibras elásticas com sua progressiva fragmentação, alterações da compactação do colágeno e espessamento da membrana basal com o envelhecimento.Conclusão - O envelhecimento leva à redução da espessura da derme e epiderme, bem como ao aplanamento da junção dermo-epidérmica. As mudanças da pele ao longo da vida nem sempre seguem um perfil linear, mostrando drásticas alterações nas últimas décadas de vida. O método de autofluorescência mostrou-se um instrumento valioso no estudo da complexa relação espacial das fibras elásticas e colágenas