RESUMEN

Croton antisyphiliticus Mart. is a medicinal plant native to Cerrado vegetation in Brazil, and it is popularly used to treat urogenital tract infections. The objective of the present study was to assess the genetic variability of natural C. antisyphiliticus populations using AFLP molecular markers. Accessions were collected in the states of Minas Gerais, São Paulo, and Goiás. The genotyping of individuals was performed using a LI-COR® DNA Analyzer 4300. The variability within populations was found to be greater than the variability between them. The F(ST) value was 0.3830, which indicated that the populations were highly structured. A higher percentage of polymorphic loci (92.16%) and greater genetic diversity were found in the population accessions from Pratinha-MG. Gene flow was considered restricted (N(m) = 1.18), and there was no correlation between genetic and geographic distances. The populations of C. antisyphiliticus exhibited an island-model structure, which demonstrates the vulnerability of the species.

Asunto(s)

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O presente estudo teve como principal objetivo avaliar o potencial de atividade antimicrobiana de diterpeno isolado de Croton antisyphiliticus, espécie nativa do Cerrado, frente biofilme de Staphylococcus aureus, isolados do leite de animais com mastite. O diterpeno ácido ent-kaur-16-en-18-óico foi avaliado quanto à capacidade de erradicação da biomassa e também à redução da população bacteriana sob o biofilme. O antibiótico sulfato de gentamicina foi utilizado como tratamento comparativo. A atividade antibiofilme foi determinada por meio dos métodos do Cristal Violeta e da Contagem de Unidades Formadoras de Colônia. Os resultados obtidos demonstraram que o ácido ent-kaur-16-en-18- óico, na concentração de 250 µg/mL, reduziu 56% da biomassa formada, enquanto a gentamicina, na concentração de 30 mg/mL, apenas 13%. Quanto à atividade nas células bacterianas sob o biofilme, não houve diferença estatística significativa entre os tratamentos, que minimizaram cerca de 3 logs da população de S. aureus. Portanto, nas condições ensaiadas, o diterpeno ent-kaur-16-en-18-óico destacou-se por apresentar atividade antibiofilme significativa contra S. aureus, em concentração 120 vezes menor quando comparado ao antibiótico gentamicina.

The present study aimed to evaluate the potential antimicrobial activity of diterpene isolated from Croton antisyphiliticus, native species of the Cerrado, against biofilm of Staphylococcus aureus isolated from milk from animals with mastitis. The diterpene ent-Kaur-16-on-18-oic acid were evaluated for their ability to eradicate biomass and also reducing the bacterial population in the biofilm. The antibiotic gentamicin was used as a comparative treatment. Antibiofilm activity was determined by the methods of Crystal Violet and Count of Colony Forming Units. The results demonstrated that the ent-Kaur-16-on-18-oic acid, at a concentration of 250 μg/mL, reduced 56% of the biomass formed, while gentamicin, at a concentration of 30 mg/ml, only 13%. Regarding the activity in bacterial cells in the biofilm, there was no statistically significant difference between treatments, that minimized about 3 logs of the population of S.aureus. Therefore, in the conditions tested, the diterpene ent-kaur-16-on-18-oic highlighted for presenting antibiofilm significant activity against S. aureus, at a concentration 120 times lower when compared to the gentamicin antibiotic.

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O presente estudo teve como principal objetivo avaliar o potencial de atividade antimicrobiana de diterpeno isolado de Croton antisyphiliticus, espécie nativa do Cerrado, frente biofilme de Staphylococcus aureus, isolados do leite de animais com mastite. O diterpeno ácido ent-kaur-16-en-18-óico foi avaliado quanto à capacidade de erradicação da biomassa e também à redução da população bacteriana sob o biofilme. O antibiótico sulfato de gentamicina foi utilizado como tratamento comparativo. A atividade antibiofilme foi determinada por meio dos métodos do Cristal Violeta e da Contagem de Unidades Formadoras de Colônia. Os resultados obtidos demonstraram que o ácido ent-kaur-16-en-18-óico, na concentração de 250 µg/mL, reduziu 56% da biomassa formada, enquanto a gentamicina, na concentração de 30 mg/mL, apenas 13%. Quanto à atividade nas células bacterianas sob o biofilme, não houve diferença estatística significativa entre os tratamentos, que minimizaram cerca de 3 logs da população de S. aureus.  Portanto, nas condições ensaiadas, o dite

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O presente estudo teve como principal objetivo avaliar o potencial de atividade antimicrobiana de diterpeno isolado de Croton antisyphiliticus, espécie nativa do Cerrado, frente biofilme de Staphylococcus aureus, isolados do leite de animais com mastite. O diterpeno ácido ent-kaur-16-en-18-óico foi avaliado quanto à capacidade de erradicação da biomassa e também à redução da população bacteriana sob o biofilme. O antibiótico sulfato de gentamicina foi utilizado como tratamento comparativo. A atividade antibiofilme foi determinada por meio dos métodos do Cristal Violeta e da Contagem de Unidades Formadoras de Colônia. Os resultados obtidos demonstraram que o ácido ent-kaur-16-en-18- óico, na concentração de 250 µg/mL, reduziu 56% da biomassa formada, enquanto a gentamicina, na concentração de 30 mg/mL, apenas 13%. Quanto à atividade nas células bacterianas sob o biofilme, não houve diferença estatística significativa entre os tratamentos, que minimizaram cerca de 3 logs da população de S. aureus. Portanto, nas condições ensaiadas, o diterpeno ent-kaur-16-en-18-óico destacou-se por apresentar atividade antibiofilme significativa contra S. aureus, em concentração 120 vezes menor quando comparado ao antibiótico gentamicina.(AU)

The present study aimed to evaluate the potential antimicrobial activity of diterpene isolated from Croton antisyphiliticus, native species of the Cerrado, against biofilm of Staphylococcus aureus isolated from milk from animals with mastitis. The diterpene ent-Kaur-16-on-18-oic acid were evaluated for their ability to eradicate biomass and also reducing the bacterial population in the biofilm. The antibiotic gentamicin was used as a comparative treatment. Antibiofilm activity was determined by the methods of Crystal Violet and Count of Colony Forming Units. The results demonstrated that the ent-Kaur-16-on-18-oic acid, at a concentration of 250 μg/mL, reduced 56% of the biomass formed, while gentamicin, at a concentration of 30 mg/ml, only 13%. Regarding the activity in bacterial cells in the biofilm, there was no statistically significant difference between treatments, that minimized about 3 logs of the population of S.aureus. Therefore, in the conditions tested, the diterpene ent-kaur-16-on-18-oic highlighted for presenting antibiofilm significant activity against S. aureus, at a concentration 120 times lower when compared to the gentamicin antibiotic.(AU)

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A bactéria Staphylococcus aureus destaca-se como agente etiológico mais prevalente da mastite bovina, principal enfermidade que acomete os rebanhos leiteiros. Dentre os fatores de virulência do microrganismo, a capacidade de formar biofilmes, que são bactérias aderidas a uma superfície envolvidas por uma matriz de polímeros orgânicos, confere grande resistência à ação dos antibióticos (COSTERTON et al, 1999). Estudos recentes demonstram atividade significativa de compostos vegetais sobre biofilmes bacterianos (COBRADO et al, 2013). O objetivo do estudo foi avaliar o potencial do extrato clorofórmico de Croton antisyphiliticus na erradicação de biofilme de Staphylococcus aureus, isolados de leite de animais com mastite bovina. O extrato clorofórmico da raíz de Croton antisyphiliticus foi preparado na concentração de 5 mg/mL. O sulfato de gentamicina (30 mg/mL) foi utilizado como comparativo, devido sua ampla utilização comercial. Para a formação do biofilme 10 estirpes foram padronizadas (105 UFC/mL) e incubadas a 37°C por 24 horas, sob agitação (120rpm), em placas de 96 poços. As placas foram lavadas com solução salina 0,9%, seguida da adição de 100µL do extrato e incubação por 24 horas, nas mesmas condições. Para mensuração da biomassa foi aplicada a técnica do Cristal Violeta e posteriormente leitura em espectrofotômetro (492nm) (GOMES, 2010). Os resultados foram expressos em porcentagem e o inoculo (livre de tratamento) foi utilizado como controle positivo (100% de aderência). De acordo com a média obtida o extrato em estudo erradicou 28,5% da biomassa, na concentração de 5mg/mL, enquanto a gentamicina erradicou 14%, na concentração de 30mg/mL. Sendo assim, o extrato de Corotn antisyphiliticus demonstrou considerável capacidade de erradicação da biomassa de S. aureus nas condições ensaiadas, principalmente quando comparado com o antibiótico mais utilizado para tratamento da mastite bovina. Estudos mais minuciosos fazem-se necessários na tentativa de identificar substâncias de origem vegetal com potencial terapêutico promissor.

Staphylococcus aureus is the most prevalent etiologic agent of bovine mastitis, the main disease affecting dairy herds. Among the virulence factors of this pathogen is the ability to form biofilms, made of bacteria adhered to a surface enclosed by an array of organic polymers, that confers high resistance to antibiotic action (COSTERTON et al., 1999). Recent studies have demonstrated significant activity of plant compounds on bacterial biofilms (COBRADO et al., 2013). This study aims to evaluate the potential of chloroform extract of Croton antisyphiliticus to remove the Staphylococcus aureus biofilm isolated from milk from animals with bovine mastitis. The chloroform extract was prepared from the root of Croton antisyphiliticus at a concentration of 5 mg/mL. Gentamicin sulphate (30 mg/ml) was used as a comparison due to its wide commercial use. For the formation of biofilms 10 strains were standardized (105 UFC/mL) and incubated at 37°C for 24 hours under agitation (120 rpm) in 96-well plates. The plates were washed with 0.9% saline solution, followed by addition of 100mL extract and incubated for 24 hours in the same conditions. The biomass was measured using the crystal violet technique for further spectrophotometer reading (492 nm) (Gomes, 2010). The results were expressed as percentage and the inoculum (treatment-free) was used as a positive control (100% adhesion). The results showed that the studied extract removed an average 28.5% of the biomass at a concentration of 5mg/mL while gentamicin removed 14% at a concentration of 30mg/mL. Therefore, the Croton antisyphiliticus extract has shown considerable ability to remove the S. aureus biomass under the conditions tested, especially when compared to widely used antibiotics to treat mastitis in cattle. Further studies are required in order to identify substances of vegetable origin with promising therapeutic potential.

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            A bactéria Staphylococcus aureus destaca-se como agente etiológico mais prevalente da mastite bovina, principal enfermidade que acomete os rebanhos leiteiros. Dentre os fatores de virulência do microrganismo, a capacidade de formar biofilmes, que são bactérias aderidas a uma superfície envolvidas por uma matriz de polímeros orgânicos, confere grande resistência à ação dos antibióticos (COSTERTON et al, 1999). Estudos recentes demonstram atividade significativa de compostos vegetais sobre biofilmes bacterianos (COBRADO et al, 2013). O objetivo do estudo foi avaliar o potencial do extrato clorofórmico de Croton antisyphiliticus na erradicação de biofilme de Staphylococcus aureus, isolados de leite de animais com mastite bovina. O extrato clorofórmico da raíz de Croton antisyphiliticus foi preparado na concentração de 5 mg/mL. O sulfato de gentamicina (30 mg/mL) foi utilizado como comparativo, devido sua ampla utilização comercial. Para a formação do biofilme 10 estirpes foram padronizadas (105 UFC/mL) e incubadas a 37°C por 24 horas, sob agit

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            A bactéria Staphylococcus aureus destaca-se como agente etiológico mais prevalente da mastite bovina, principal enfermidade que acomete os rebanhos leiteiros. Dentre os fatores de virulência do microrganismo, a capacidade de formar biofilmes, que são bactérias aderidas a uma superfície envolvidas por uma matriz de polímeros orgânicos, confere grande resistência à ação dos antibióticos (COSTERTON et al, 1999). Estudos recentes demonstram atividade significativa de compostos vegetais sobre biofilmes bacterianos (COBRADO et al, 2013). O objetivo do estudo foi avaliar o potencial do extrato clorofórmico de Croton antisyphiliticus na erradicação de biofilme de Staphylococcus aureus, isolados de leite de animais com mastite bovina. O extrato clorofórmico da raíz de Croton antisyphiliticus foi preparado na concentração de 5 mg/mL. O sulfato de gentamicina (30 mg/mL) foi utilizado como comparativo, devido sua ampla utilização comercial. Para a formação do biofilme 10 estirpes foram padronizadas (105 UFC/mL) e incubadas a 37°C por 24 horas, sob agit

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A bactéria Staphylococcus aureus destaca-se como agente etiológico mais prevalente da mastite bovina, principal enfermidade que acomete os rebanhos leiteiros. Dentre os fatores de virulência do microrganismo, a capacidade de formar biofilmes, que são bactérias aderidas a uma superfície envolvidas por uma matriz de polímeros orgânicos, confere grande resistência à ação dos antibióticos (COSTERTON et al, 1999). Estudos recentes demonstram atividade significativa de compostos vegetais sobre biofilmes bacterianos (COBRADO et al, 2013). O objetivo do estudo foi avaliar o potencial do extrato clorofórmico de Croton antisyphiliticus na erradicação de biofilme de Staphylococcus aureus, isolados de leite de animais com mastite bovina. O extrato clorofórmico da raíz de Croton antisyphiliticus foi preparado na concentração de 5 mg/mL. O sulfato de gentamicina (30 mg/mL) foi utilizado como comparativo, devido sua ampla utilização comercial. Para a formação do biofilme 10 estirpes foram padronizadas (105 UFC/mL) e incubadas a 37°C por 24 horas, sob agitação (120rpm), em placas de 96 poços. As placas foram lavadas com solução salina 0,9%, seguida da adição de 100µL do extrato e incubação por 24 horas, nas mesmas condições. Para mensuração da biomassa foi aplicada a técnica do Cristal Violeta e posteriormente leitura em espectrofotômetro (492nm) (GOMES, 2010). Os resultados foram expressos em porcentagem e o inoculo (livre de tratamento) foi utilizado como controle positivo (100% de aderência). De acordo com a média obtida o extrato em estudo erradicou 28,5% da biomassa, na concentração de 5mg/mL, enquanto a gentamicina erradicou 14%, na concentração de 30mg/mL. Sendo assim, o extrato de Corotn antisyphiliticus demonstrou considerável capacidade de erradicação da biomassa de S. aureus nas condições ensaiadas, principalmente quando comparado com o antibiótico mais utilizado para tratamento da mastite bovina. Estudos mais minuciosos fazem-se necessários na tentativa de identificar substâncias de origem vegetal com potencial terapêutico promissor.(AU)

Staphylococcus aureus is the most prevalent etiologic agent of bovine mastitis, the main disease affecting dairy herds. Among the virulence factors of this pathogen is the ability to form biofilms, made of bacteria adhered to a surface enclosed by an array of organic polymers, that confers high resistance to antibiotic action (COSTERTON et al., 1999). Recent studies have demonstrated significant activity of plant compounds on bacterial biofilms (COBRADO et al., 2013). This study aims to evaluate the potential of chloroform extract of Croton antisyphiliticus to remove the Staphylococcus aureus biofilm isolated from milk from animals with bovine mastitis. The chloroform extract was prepared from the root of Croton antisyphiliticus at a concentration of 5 mg/mL. Gentamicin sulphate (30 mg/ml) was used as a comparison due to its wide commercial use. For the formation of biofilms 10 strains were standardized (105 UFC/mL) and incubated at 37°C for 24 hours under agitation (120 rpm) in 96-well plates. The plates were washed with 0.9% saline solution, followed by addition of 100mL extract and incubated for 24 hours in the same conditions. The biomass was measured using the crystal violet technique for further spectrophotometer reading (492 nm) (Gomes, 2010). The results were expressed as percentage and the inoculum (treatment-free) was used as a positive control (100% adhesion). The results showed that the studied extract removed an average 28.5% of the biomass at a concentration of 5mg/mL while gentamicin removed 14% at a concentration of 30mg/mL. Therefore, the Croton antisyphiliticus extract has shown considerable ability to remove the S. aureus biomass under the conditions tested, especially when compared to widely used antibiotics to treat mastitis in cattle. Further studies are required in order to identify substances of vegetable origin with promising therapeutic potential.(AU)

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O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de atividade antimicrobiana in vitro dos extratos de algumas plantas endêmicas do Cerrado tais como Baccharis dracunculifolia. Cochlospermum regium. Croton antisyphiliticus. Eugenia dysenterica e Lippia sidoides, frente ao agente Staphylococcus aureus isolado de leite mastítico, ósteo do teto da vaca, equipamento de ordenhadeira, fossas nasais e garganta do ordenhador. Os extratos foram preparados a partir das partes aéreas e sistema radicular das plantas utilizando os solventes metanol, hexano e clorofórmio na concentração de 10%. Para avaliação da atividade antimicrobiana foi aplicada a técnica de microdiluição em caldo para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) seguida da determinação da Concentração Bactericida Mínima (MBC). Os extratos de Baccharis dracunculifolia. Croton antisyphiliticus, seguido do extrato de Lippia sidoides, apresentaram, respectivamente, melhor atividade inibitória sobre a multiplicação da bactéria Staphylococcus aureus. Os resultados obtidos demonstraram, ainda, que as estirpes isoladas do leite e das fossas nasais do ordenhador foram resistentes a gentamicina, princípio ativo muito utilizado no combate à mastite bovina, porém sensíveis aos extratos das plantas referidas, reforçando a importância das plantas medicinais como recurso terapêutico e sua aplicabilidade.

The objective of this study is to evaluate the potencial microbial activity in-vitro from the extract of some endemic plants from Cerrado such as Baccharis dracunculifolia. Cochlospermum regium. Croton antisyphiliticus. Eugenia dysenterica and Lippia sidoides, against the agent Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitic milk, osteo from cow's teat, milker equipament, nasal cavitites and milker's gullet. The extracts were prepared from aerial parts as well as the reticular systems of plants using the solvents methanol, hexane and chloroform at a concentration of 10%. To evaluate the antimicrobial activity, the technique of microdilution in broth was used for determining the Minimal Inibitory Concentration (MIC) followed by the determination of Minimal Bactericidal Concentration (MBC). The extracts from Baccharis dracunculifolia and Croton antisyphiliticus, followed by extracts from Lippia sidoides, reported respectively, presented better inhibitory activity against the multiplication of the bacteria Staphylococcus aureus. Furthermore, the results demonstrate that the isolated strains from the milk and nasal cavities of the milker showed strong resistance against gentamicin, active agent commonly applied to combat mastitis bovine. However, there was sensitivity against extracts from the reported plants, reinforcing the importance of the medicinal plants as a therapeutic resource and its aplicability.

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ABSTRACT The objective of this study is to evaluate the potencial microbial activity in-vitro from the extract of some endemic plants from Cerrado such as Baccharis dracunculifolia. Cochlospermum regium. Croton antisyphiliticus. Eugenia dysenterica and Lippia sidoides, against the agent Staphylococcus aureus isolated from bovine mastitic milk, osteo from cows teat, milker equipament, nasal cavitites and milkers gullet. The extracts were prepared from aerial parts as well as the reticular systems of plants using the solvents methanol, hexane and chloroform at a concentration of 10%. To evaluate the antimicrobial activity, the technique of microdilution in broth was used for determining the Minimal Inibitory Concentration (MIC) followed by the determination of Minimal Bactericidal Concentration (MBC). The extracts from Baccharis dracunculifolia and Croton antisyphiliticus, followed by extracts from Lippia sidoides, reported respectively, presented better inhibitory activity against the multiplication of the bacteria Staphylococcus aureus. Furthermore, the results demonstrate that the isolated strains from the milk and nasal cavities of the milker showed strong resistance against gentamicin, active agent commonly applied to combat mastitis bovine. However, there was sensitivity against extracts from the reported plants, reinforcing the importance of the medicinal plants as a therapeutic resource and its aplicability.

RESUMO O presente estudo teve como objetivo avaliar o potencial de atividade antimicrobiana in vitro dos extratos de algumas plantas endêmicas do Cerrado tais como Baccharis dracunculifolia. Cochlospermum regium. Croton antisyphiliticus. Eugenia dysenterica e Lippia sidoides, frente ao agente Staphylococcus aureus isolado de leite mastítico, ósteo do teto da vaca, equipamento de ordenhadeira, fossas nasais e garganta do ordenhador. Os extratos foram preparados a partir das partes aéreas e sistema radicular das plantas utilizando os solventes metanol, hexano e clorofórmio na concentração de 10%. Para avaliação da atividade antimicrobiana foi aplicada a técnica de microdiluição em caldo para determinação da Concentração Inibitória Mínima (CIM) seguida da determinação da Concentração Bactericida Mínima (MBC). Os extratos de Baccharis dracunculifolia. Croton antisyphiliticus, seguido do extrato de Lippia sidoides, apresentaram, respectivamente, melhor atividade inibitória sobre a multiplicação da bactéria Staphylococcus aureus. Os resultados obtidos demonstraram, ainda, que as estirpes isoladas do leite e das fossas nasais do ordenhador foram resistentes a gentamicina, princípio ativo muito utilizado no combate à mastite bovina, porém sensíveis aos extratos das plantas referidas, reforçando a importância das plantas medicinais como recurso terapêutico e sua aplicabilidade.

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Catuaba (Anemopaegma arvense), a Bignoniaceae species endemic to Cerrado regions, shows anticancer properties and is widely used as a stimulant in traditional medicine. We evaluated the genetic diversity of seven populations found in the State of São Paulo, using random amplified polymorphic DNA markers. After optimization of the amplification reaction, 10 selected primers produced 70 reproducible bands, with 72.8% polymorphism. The greatest genetic diversity was observed within populations (71.72%). Variation estimates, theta(B) (0.2421) and Phi(ST) (0.283), obtained by inter- and intra-populational analysis of genetic variability of catuaba, indicated considerable population structure. However, the r value 0.346 (P = 0.099), calculated by the Mantel test, indicates that the genetic diversity among populations is not strongly structured in geographical space, although there appears to be a tendency towards structuring.

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