RESUMEN

BACKGROUND: Behavior rhythms of insect vectors directly interfere with the dynamics of pathogen transmission to humans. The sand fly Lutzomyia longipalpis is the main vector of visceral leishmaniasis in America and concentrates its activity around dusk. Despite the accumulation of behavioral data, very little is known about the molecular bases of the clock mechanism in this species. This study aims to characterize, within an evolutionary perspective, two important circadian clock genes, Clock and vrille. FINDINGS: We have cloned and isolated the coding sequence of L. longipalpis' genes Clock and vrille. The former is structured in eight exons and encodes a protein of 696 amino acids, and the latter comprises three exons and translates to a protein of 469 amino acids. When compared to other insects' orthologues, L. longipalpis CLOCK shows a high degree of conservation in the functional domains bHLH and PAS, but a much shorter glutamine-rich (poly-Q) C-terminal region. As for L. longipalpis VRILLE, a high degree of conservation was found in the bZIP domain. To support these observations and provide an elegant view of the evolution of both genes in insects, phylogenetic analyses based on maximum-likelihood and Bayesian inferences were performed, corroborating the previously known insect systematics. CONCLUSIONS: The isolation and phylogenetic analyses of Clock and vrille orthologues in L. longipalpis bring novel and important data to characterize this species' circadian clock. Interestingly, the poly-Q shortening observed in CLOCK suggests that its transcription activity might be impaired and we speculate if this effect could be compensated by other clock factors such as CYCLE.

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Os ritmos diários de atividade e repouso de insetos vetores são controlados pelorelógio circadiano. Este mecanismo endógeno que controla diferentes aspectos dafisiologia, metabolismo e comportamento, pode ser sincronizado pela luz (ciclos declaro e escuro) e outros ciclos ambientais como as oscilações diárias natemperatura, disponibilidade de alimentos, etc. Os genes diretamente envolvidos nocontrole molecular do relógio circadiano foram primeiramente descritos no modeloDrosophila melanogaster. Nosso grupo tem estudado genes do relógio circadianoem insetos vetores utilizando D. melanogaster como modelo, o que tem reveladouma série de diferenças marcantes entre os ortólogos do relógio de insetos. EmLutzomyia longipalpis, principal vetor da Leishmania infantum nas Américas, eAedes aegypti, vetor do vírus Dengue, a proteína codificada pelo gene cycle (cyc)possui uma cauda de ativação do tipo BCTR muito semelhante à de vertebrados.Esse sítio (BCTR) corresponde a região de interação de CYC com a proteínaCRYPTOCHROME 2, um repressor transcricional encontrado em diversos insetosmas ausente em D. melanogaster. Outra diferença importante entre esses insetos éem relação ao tamanho da cauda poli-Q, implicada na ativação gênica, pois tantoem L. longiplapis quanto em Ae. aegypti esta cauda é reduzida em relação aomodelo Drosophila. Isto sugere que durante a evolução o domínio BCTR foisubstituído funcionalmente em algumas espécies pelo domínio poli-Q noheterodímero CLOCK/CYCLE (CLK/CYC). Neste trabalho, iniciamos umainvestigação dos aspectos relacionados à conservação evolutiva e funcional daprincipal alça regulatória do relógio circadiano de insetos. Para isto, através de umaanálise in vivo, dirigimos a expressão do gene cyc de L. longipalpis (llcyc) natentativa de reconstruir, em parte, a primeira alça do relógio circadiano de L.longipalpis em mutantes de D. melanogaster...

Daily rhythms of activity and rest in insect vectors are controlled by the circadianclock. This endogenous mechanism that controls various aspects of physiology,metabolism and behavior can be synchronized by the light (light and dark cycles) andother environmental cycles as the daily fluctuations in temperature, food availability,etc. The genes directly involved in the molecular circadian clock control were firstdescribed in Drosophila melanogaster. Our group has been studying circadian clockgenes in insect vectors using D. melanogaster as a model, revealing a series ofmarked differences among the orthologs of the insects clock. In Lutzomyialongipalpis, vector of Leishmania infantum in the Americas, and Aedes aegypti, theDengue virus vector, the protein encoded by cycle (cyc) gene has a BCTR type tailactivation, very similar to that of vertebrates. This BCTR tail is the site of interactionwith the CRYPTOCHROME 2 protein, a transcriptional repressor found in manyinsects, but absent in D. melanogaster. Another important difference among theseinsects is relative to poly-Q tail size, implicated in gene activation, since both L.longipalpis and Ae. aegypti have a reduced tail compared to Drosophila. Thissuggests that during the evolution the BCTR domain was functionally replaced insome species by poly-Q domain in the heterodimer CLOCK/CYCLE (CLK/CYC). Inthe present work, we have started an investigation of aspects related to theevolutionary and functional conservation of the main regulatory circadian clock ininsects. For this purpose, through an in vivo analysis we drove the L. longipalpis cyc(llcyc) gene expression in an attempt to rebuild, in part, the first circadian clock loopof L. longipalpis in mutants of D. melanogaster...

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O relógio circadiano, presente em diversos organismos, é um mecanismo que controla ritmos diários na fisiologia e comportamento, os quais são mantidos mesmo na ausência de estímulos externos. Estudos em Drosophila melanogaster revelaram genes envolvidos diretamente com este relógio biológico. Tais genes formam alças de autoregulação negativa que promovem a transcrição cíclica de alguns dos seus próprios componentes assim como de outros genes que controlam uma variedade de aspectos fisiológicos e comportamentais. A principal alça regulatória é composta por dois ativadores transcricionais, Clock (Clk) e Cycle (Cyc), que após formarem um heterodímero, promovem a transcrição de period (per) e timeless (tim). Por sua vez, as proteínas Period (Per) e Timeless (Tim) também formam dímeros, entram no núcleo e interagem com Clk e Cyc, causando a desestabilização destes ativadores transcricionais e, consequentemente, a repressão de suas próprias transcrições. Nosso grupo tem estudado genes do relógio circadiano em Lutzomyia longipalpis, principal vetor da Leishmania chagasi (= Le. infantum) nas Américas. Comparações entre nossos resultados e o que é conhecido em D. melanogaster revelaram diferenças interessantes. Em D. melanogaster, a proteína Clk possui uma cauda de ativação formada por um domínio poli-Q, que está ausente no mutante arrítmico Clk jrk . Em L. longipalpis, Clk parece não possuir esta cauda de ativação. Contudo, a proteína Cyc deste inseto possui uma região homóloga ao domínio de ativação encontrada em proteínas ortólogas de outros insetos e vertebrados, mas que está ausente na proteína Cyc de D. melanogaster. Finalmente, o gene cyc é expresso de modo distinto em cada espécie: em L. longipalpis, o mRNA de cyc oscila quantitativamente ao longo do dia ao passo que, em D. melanogaster, apresenta expressão constitutiva. Uma construção contendo o gene cyc de L. longipalpis (llcyc) foi permanentemente introduzida em D. melanogaster utilizando a transformação mediada pelo elemento de transposição “P”. Utilizando o sistema UAS-GAL4, analisamos a atividade locomotora de moscas transformadas expressando esta construção em diferentes grupos neuronais e backgrounds genéticos de D. melanogaster. Embora L. longipalpis seja um inseto crepuscular/noturno e D. melanogaster diurno, a presença de llcyc não tornou as moscas transformadas mais noturnas. Contudo, o padrão de atividade em ciclos de claro-escuro sofreu mudanças e o período endógeno foi reduzido quando expostas à escuridão constante. Os resultados sugerem que a proteína Cyc de L. longipalpis, com sua cauda de ativação, interfere no funcionamento do relógio circadiano de D. Melanogaster.

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